LAPORAN
PRAKTIKUM
FITOKIMIA
II
Isolasi
dan Idendtifikasi Fraksi Aktif dari Ekstrak Daun Bunga Terompet (Mandevillae
sanderi) menggunakan Kromatografi
Kolom Konvensional,Kromatografi Cair Vakum dan
Kromatografi
Lapis Tipis Preparatif
OLEH
:
NAMA : Murdianto Usi
RL
STAMBUK : 150
2010 170
KELOMPOK : II (DUA)
KELAS
: L 1
ASISTEN : IRAMAYASARI
S.Farm,Apt
LABORATORIUM
FARMAKOGNOSI
- FITOKIMIA
FAKULTAS
FARMASI
UNIVERSITAS
MUSLIM INDONESIA
MAKASSAR
2013
BAB
I
PENDAHULUAN
I.1 Latar Belakang
Istilah kromatografi mula-mula ditemukan oleh
Michael Tswett (1908), seorang ahli botani Rusia. Nama kromatografi diambil
dari bahasa Yunani (chromato = penulisan dan grafe =
warna). Kromatografi berarti penulisan dengan warna. Kromatografi adalah cara
pemisahan campuran yang didasarkan atas perbedaan distribusi dari komponen
campuran tersebut diantara dua fase, yaitu fase diam (stationary) dan
fasa bergerak (mobile). Fasa diam dapat berupa zat padat atau zat cair,
sedangkan fasa bergerak dapat berupa zat cair atau gas. Teknologi yang penting untuk
analisis dan pemisahan preparatif pada campuran bahan adalah prinsip dasar
kromatografi.
Pemilihan
teknik kromatografi sebagian besar bergantung pada sifat kelarutan senyawa yang
akan dipisahkan.Kromatografi digunakan sebagai untuk memisahkan substansi
campuran menjadi komponen-komponennya, misalnya senyawa Flavonoida yang
terdapat pada tahu, tempe, bubuk isoflavon memiliki banyak manfaat.
Kromatografi Lapis
Tipis (KLT) merupakan cara pemisahan campuran senyawa menjadi senyawa murninya
dan mengetahui kuantitasnya yang menggunakan. Kromatografi juga merupakan
analisis cepat yang memerlukan bahan sangat sedikit, baik penyerap maupun
cuplikannya.
KLT dapat digunakan untuk memisahkan senyawa – senyawa yang sifatnya hidrofobik seperti lipida – lipida dan hidrokarbon yang sukar dikerjakan dengan kromatografi kertas. KLT juga dapat berguna untuk mencari eluen untuk kromatografi kolom, analisis fraksi yang diperoleh dari kromatografi kolom, identifikasi senyawa secara kromatografi, dan isolasi senyawa murni skala kecil.
KLT dapat digunakan untuk memisahkan senyawa – senyawa yang sifatnya hidrofobik seperti lipida – lipida dan hidrokarbon yang sukar dikerjakan dengan kromatografi kertas. KLT juga dapat berguna untuk mencari eluen untuk kromatografi kolom, analisis fraksi yang diperoleh dari kromatografi kolom, identifikasi senyawa secara kromatografi, dan isolasi senyawa murni skala kecil.
Beberapa
kelabihan senyawa isoflavon yang potensial bagi kesehatan manusia, diantaranya
adalah sebagai antioksidan, antitumor / antikanker, antikolestrol, antivirus,
antialergi, dan dapat mencegah osteoporosis. Dan semua kromatografi bekerja
berdasarkan metode kromatografi.
I.2 Maksud dan Tujuan
I.2.1 Maksud
Adapun maksud dari praktikum ini adalah
1.
Untuk
mengetahui dan memahami cara pemisahan
senyawa pada ekstrak daun bunga terompet
(Mandivella sanderi) menggunakan kromatografi kolom
konvensional.
2.
Untuk
mengetahui dan memahami cara memisahkan
sampel ekstrak daun bunga terompet
(Mandivella sanderi) dengan menggunakan kromatografi kolom
cair vakum.
3. Untuk
mengetahui dan memahami metode penentuan komponen kimia secara kromatografi
lapis tipis preparatif yang terdapat dalam fraksi kasar n-heksan daun bunga
terompet (Mandivella sanderi)
1.2.2 Tujuan
Adapun tujuan dilakukannya percobaan kali ini adalah
1.
Untuk menentukan nilai Rf masing-masing noda kromatogram dari sampel ekstrak daun bunga terompet
(Mandivella sanderi) dengan menggunakan meode kromatografi kolom
konvensional
2.
Untuk menentukan nilai Rf masing-masing noda kromatogram dari sampel ekstrak
daun bunga terompet
(Mandivella sanderi) dengan menggunakan meode kromatografi kolom
cair vakum
3.
untuk memisahkan
campuran senyawa dalam fraksi kasar n-heksan daun bunga terompet (Mandivella
sanderi) dengan metode kromatografi lapis tipis praparatif dan untuk
mengetahui nilai Rf.
BAB II
TINJAUAN PUSTAKA
Klasifikasi Ilmiah (http://www.plantamor.com/index.php?plant=1940)
Kingdom : Plantae (Tumbuhan)
Subkingdom : Tracheobionta (Tumbuhan berpembuluh)
Super Divisi : Spermatophyta (Menghasilkan biji)
Divisi : Magnoliophyta (Tumbuhan berbunga)
Kelas : Magnoliopsida (Berkeping dua /
dikotil)
Sub Kelas : Asteridae
Ordo :
Gentianales
Famili : Apocynaceae
Genus : Mandevilla
Spesies : Mandevilla
sanderi
Ciri - ciri Umum Bunga Terompet
Bunga terompet
merupakan tumbuhan berkeping dua/ dikotil. Berikut ini ciri-ciri dari bunga terompet, yaitu (http://deztriya.blogspot.com/2012/04/tumbuhan-biji-terbuka-dan
tertutup.html) :
Ciri Umum
|
Penjelasan
|
Biji
|
· Biji mempunyai lembaga dengan 2
lembaga
|
Lembaga/ kecambah
|
· Akar lembaga tumbuh terus menjadi
akar tungggang yang bercabang-cabang dan akhirnya membentuk sistem akar
tunggang
· Ujung akar lembaga dan ujung pucuk
lembaga tidak mempunyai pelindung khusus
|
Batang
|
· Batang dari pangkal ke ujung
seperti kerucut panjang, bercabang-cabang, buku-buku dan ruas tidak jelas
|
Daun
|
· Daun tunggal atau majemuk,
seringkali disertai daun penumpu, jarang mempunyai upih
· Daun duduknya tersebar atau
berkarang
· Tulang daun menjari atau menyirip
|
Bunga
|
· Bagian-bagian bunga berjumlah 2, 4
atau 5
|
Anatomi
|
· Baik akar maupun batang mempunyai
kambium, sehingga dapat tumbuh membesar (pertumbuhan sekunder)
· Letak berkas pembuluh melingkar
|
Mandevilla Sandersi tanaman rambat berbunga dengan banyak
pilihan warna.Tanaman rambat memang banyak digunakan untuk menciptakan suasana
rumah yang asri. Disitu memang tanaman rambat akan lebih mendukung konsep
tersebut karena mampu tumbuh rimbun dan mempunyai bunga yang berwarna cerah.
Kesan yang muncul selain teduh juga mampu memberikan kombinsai warna yang
menawan. Mandevilla sendiri disebut juga sebagai bunga terompet karena bunga
yang muncul mirip seperti terompet. Tanaman ini diyakini berasal dari wilayah
Florida, Amerika Serikat dengan kombinasi warna yang beragam mulai dari merah,
putih, dan pink. Bentuk kelopak juga cukup beragam salah satunya mampu tumbuh
menumpuk seperti halnya adenium dokson atau bunga mawar. Tanaman yang cukup
melegenda di dunia landscape dan eksterior ini mempunyai karakter membutuhkan
sinar matahari penuh untuk tumbuh. Kondisi ini tentu sangat cocok dengan fungsi
tanaman sebagai naungan. Apalagi bila lokasi rumah berada di daerah perkotaan
yang punya suhu udara sangat panas.
Menurut Badrun Sutiyuko dari Aghissa Florist Banjarmasin yang
menjual mandevilla, tanaman ini meski berasal dari wilayah yang dingin namun
bisa tumbuh baik dengan lingkungan yang panas. Bahkan semakin banyak terkena
sinar matahari warna yang muncul akan makin cerah. Secara fisiologis tanaman
ini hampir tidak berbeda dengan tanaman merambat lainnya yaitu punya batang
yang menjulur dan akar yang menempel pada tempat naungan. Kelebihan yang paling
menonjol pada tanaman ini adalah bentuk bunga yang cukup besar. Meski disebut
juga sebagai bunga terompet namun bentuk kelopak bunga juga hampir mirip dengan
kembang sepatu (hibiscus rosa-sinensis L.)
Tanaman yang di luar negeri juga disebut sebagai brazilian
jasmine ini punya bentuk yang cukup menarik dimana untuk kelopak bunga akan
memutar dan menutup satu dengan lainnya. Bunga akan muncul diujung tangkai
sehingga semakin rimbun tanaman maka bunga akan muncul makin banyak dan
serempak (bunga kompak).
Pada bagian daun mandevilla punya karakter yang meruncing
dengan serat daun yang menonjol. Disini daun yang tumbuh tidak terlalu
mendominasi dibandingkan mekarnya bunga. Tidak seperti tanaman rambat lainnya
yang lebih mendominasi adalah daun sementara bunga hanya muncul di beberapa
bagian saja.
Tanaman yang masuk dalam keluarga apocynaceae ini memang
membutuhkan sinar matahari secara penuh untuk tumbuh. Sehingga saat menanam
mandevilla diusahakan menghadap ke arah timur atau barat untuk mendapatkan
sinar matahari yang bagus. Keunikan lain tanaman ini adalah mampu berbunga
terus tanpa henti dalam satu tahunnya.
Untuk kelangsungan hidup tanaman ini juga mampu tumbuh dengan
baik meski sudah berusia antara 3-4 tahun. Jelas kelebihan ini jauh dari jenis
tanaman lainnya yang mati setelah berbunga. Bahkan selain merambat mendevilla
juga bisa tumbuh secara menjuntai karena mempunyai batang yang lemas.
Manfaat
bunga terompat,
biasanya digunakan akar,daun dan bunga terompet untuk obat-obatan.Bunga terompet memiliki getah berwarna putih, getah
bunga terompet memilki manfaat untuk pencegah kuman/bakteri dan juga
obat penyakit kanker.
Bunga terompet
mengandung Hyoscyamine, atropine, scopolamine, sebagai zat anticholinergics
(zat penghilang kesadaran).Selain memilki warna kuning juga ada bunga terompet
berwarna putih, merah muda, ungu, orange melalui stek ataupun penyilangan.
Ciri-ciri
Bunga Terompet, Bunga terompet memiliki bentuk bunga yang dapat
mencapai ukuran diameter 5-7,5 cm, Bunga
terompet mampu tumbuh
sampai lebih dari 2 meter, Bunga
terompet memilki tangkai bungaberwarna hijau muda dan mempunyai daun agak kasar,
Bunga terompet mekar setiap tahun.
Istilah
kromatografi mula-mula ditemukan oleh Michael Tswett (1908), seorang ahli
botani Rusia. Nama kromatografi diambil dari bahasa Yunani (chromato =
penulisan dan grafe = warna). Kromatografi berarti penulisan
dengan warna. Kromatografi adalah cara pemisahan campuran yang didasarkan atas
perbedaan distribusi dari komponen campuran tersebut diantara dua fase, yaitu
fase diam (stationary) dan fasa bergerak (mobile). Fasa diam
dapat berupa zat padat atau zat cair, sedangkan fasa bergerak dapat berupa zat
cair atau gas (Yazid, 2005).
Kromatografi adalah proses melewatkan sampel melalui
suatu kolom, perbedaan kemampuan adsorpsi terhadap zat-zat yang sangat mirip
mempengaruhi resolusi zat terlarut dan menghasilkan apa yang disebut
kromatogram (Khopkar, 2008)
1. Kromatografi
Kolom Konvensional
Kromatografi
kolom adalah suatu metode pemisahan yang di dasarkan pada pemisahan daya
adsorbsi suatu adsorben terhadap suatu senyawa, baik pengotornya maupun
hasil isolasinya. Sebelumnya dilakukan percobaan tarhadap kromatografi lapis
tipis sebagai pencari kondisi eluen. Misalnya apsolsi yang cocok dengan pelarut
yang baik sehingga antara pengotor dan hasil isolasinya terpisah secara
sempurna (Kasiman, 2006).
Pada kromatografi kolom, campuran yang
akan dipisahkan diletakkan berupa pita pada bagian atas kolom, penjerap yang
berada dalam tabung kaca, tabung logam atau bahkan tabung plastik. Pelarut
(fase gerak0, dibiarkan mengalir melalui kolom karena aliran yang disebabkan
oleh gaya berat atau di dorong dengan tekanan. Pita senyawa linarut bergerak
melalui kolom dengan laju yang berbeda, memisah dan dikumpulkan berupa fraksi
ketika keluar dari atas kolom (Sudjadi, 1986).
Kromatografi kolom dikemas kering dalam
keadaan vakum agar diperoleh kerapatan kemasan maksimum. Vakum dihentikan,
pelarut yang kepolarannya rendah dituangkan ke permukaan penjerap lalu
divakumkan lagi dan siap di pakai. Cuplikan dilarutkan dalam pelarut yang
cocok, dimasukkan langsung pada bagian atas kolom atau pada lapisan prapenjerap
dan dihisap perlahan-lahan kedalam kemasan dengan memvakumkannya. Kolom dielusi
dengan campuran pelarut yang cocok, kolom dihisap sampai kering pada setiap
pengumpulam fraksi (Sudjadi, 1986).
Kolom
keromatografi atau tabung untuk pengaliran karena gaya tarik bumi (gravitasi) atau
sistem bertekanan rendah biasanya terbuat dari kaca yang dilengkapi dengan
kran. Ukuran keseluruhan kolom beragam, tetapi biasanya panjangnya
sekurang-kurangnya 10 kali garis tengah dalamnya dan mungkin juga sampai 100
kalinya. Nisbah panjang terhadap lebar sebagian besar ditentukan oleh mudah
sukarnya pemisahan, nisbah lebih besar untuk pemisahan yang lebih sukar. Ukuran
kolom dan banyaknya penjerap ditentukan oleh bobot campuran linarut yang akan
dipisahkan. Sifat, derajat, atau tingkat keaktifan penjerap, dan ukuran
partikelnya betul-betul penting dalam pengembangan sistem kromatografi. Ukuran
penjerap biasanya lebih besar daripada untuk KLT. Kemasan kolom biasanya 63-250
mikro meter untuk kolom yang dijalankan oleh gaya gravitasi (Raymond, 2006).
Kromatografi
kolom merupakan metode kromatografi klasik yang masih banyak digunakan.
Kromatografi kolom digunakan untuk memisahkan senyawa-senyawa dalam jumlah yang
banyak berdasarkan adsorpsi dan partisi. Kemasan adsorben yang sering digunakan
adalah silika gel G-60, kieselgur, Al2O3, dan Diaion.
Cara pembuatannya ada dua macam (Hargono, 1986):
1.
Cara kering yaitu silika gel dimasukkan ke dalam kolom yang telah diberi
kapaskemudian ditambahkan cairan pengelusi.
2.
Cara basah yaitu silika gel terlebih dahulu disuspensikan dengan cairan
pengelusi yangakan digunakan kemudian dimasukkan ke dalam kolom melalui dinding
kolom secarakontinyu sedikit demi sedikit hingga masuk semua, sambil kran kolom
dibuka. Eluen dialirkan hingga silika gel mapat, setelah silika gel mapat eluen
dibiarkan mengalir sampai batas adsorben kemudian kran ditutup dan sampel
dimasukkan yang terlebih dahulu dilarutkan dalam eluen sampai diperoleh
kelarutan yang spesifik. Kemudian sampel dipipet dan dimasukkan ke dalam kolom
melalui dinding kolom sedikit demi sedikit hingga masuk semua, dan kran dibuka
dan diatur tetesannya, serta cairan pengelusi ditambahkan. Tetesan yang keluar
ditampung sebagai fraksi-fraksi.
Kolom dapat
dibuat dari berbagai jenis material, seperti stainless steel, aluminium,
tembaga, gelas dan paduan silika. Sebagian besar sistem kolom modern terbuat
dari gelas atau paduan silika. Kolom konvensional dibuat dari material
pendukung yang dilapisi fase diam dari berbagai pembebanan yang dikemas di
dalam kolom. Kolom kapiler terdiri dari tabung kapiler panjang yang didalamnya
dilapisi dengan fase diam (fase diam dapat juga direkatkan langsung pada
permukaan silika). Sebagian besar kolom kapiler terbuat dari paduan silika yang
dilapisi polimer di bagian luarnya. Paduan silika sangat mudah pecah sedangkan
lapisan polimer tersebut bertindak sebagai pelindungnya (Seno, 1997).
Prinsip kerja
kromatografi kolom adalah dengan adanya perbedaan daya serap dari masing-masing
komponen, campuran yang akan diuji, dilarutkan dalam sedikit pelarut lalu di
masukan lewat puncak kolom dan dibiarkan mengalir kedalam zat menyerap. Senyawa
yang lebih polar akan terserap lebih kuat sehingga turun lebih lambat dari
senyawa non polar terserap lebih lemah dan turun lebih cepat. Zat yang di
serap dari larutan secara sempurna oleh bahan penyerap berupa pita sempit pada
kolom. Pelarut lebih lanjut / dengan tanpa tekanan udara masin-masing zat akan
bergerak turun dengan kecepatan khusus sehingga terjadi pemisahan dalam kolom (Seno, 1997).
2. Kromatografi Cair Vakum
Kromatografi Suction Column and Vacuum liquid chromatography (VLC)
atau kromatografi cair vakum (KCV) adalah bentuk kromatografi kolom yang khususnya berguna
untuk fraksinasi kasar yang cepat terhadap suatu ekstrak. Kondisi vakuma adalah alternatif untuk mempercepat aliran
fase gerak dari atas ke bawah. Metode ini sering digunakan untuk fraksinasi
awal dari suatu ekstrak non-polar atau ekstrak semipolar (Raymond, 2006).
Suction coloumn merupakan alat kromatografi yang merupakan modifikasi
kromatografi kolom serapan. Prinsip pemisahannya sama dengan kromatografi kolom
serapan. Bedanya terletak pada adanya isapan pompa vakum di bagian bawah kolom
ini. Alat ini dirancang mengingat pada kromatografi kolom serapan yang
pengerjaannya memakan waktu yang cukup lama. Prinsip pemisahan komponen kimia
berdasarkan adsorpsi dan partisi serta dipercepat dengan isapan pompa vakum.
Seperti halnya kromatografi kolom serapan, senyawa yang akan dipisahkan
dilarutkan dengan pelarut yang cocok kemudian dimasukkan dalam kolom isap,
selanjutnya ditambahkan eluen, eluen yang mengalir turun yang disebabkan oleh
isapan pompa vakum. Hasil pemisahan ditampung dalam setiap fraksi. Volume
penampungan 25 ml/fraksi dan untuk berat sampel q 10 - 30 gram volume
penampungan 50 ml/fraksi. Adsorben yang digunakan sedikit lebih berbeda yaitu
35 gram silica gel 7733 dan 10 gram silika gel 7731 (Gritter, 1991).
Manfaat dari
kromatografi ini yaitu menentukan ciri senyawa aktif penyebab efek racun atau
efek yang bermanfaat, yang ditunjukkan oleh ekstrak tumbuhan kasar bila diuji
dengan sistem biologi. Dalam hal ini kita harus memantau cara ekstraksi dan
pemisahan pada setiap tahap, yaitu untuk melacak senyawa aktif tersebut sewaktu
dimurnihkan. Kadang-kadang keaktifan hilang selama proses fraksinasi akibat
ketidakmantapan senyawa itu, dan akhirnya mungkin saja diperoleh senyawa berupa
kristal tetapi keaktifan seperti yang ditunjukkan oleh ekstrak asal(Harborne, 1987).
Fasa
diam yang digunakan dikemas dalam kolom yang digunakan dalam KCV. Proses
penyiapan fasa diam dalam kolom terbagi menjadi dua macam, yaitu(Sarker, 2006):
a)
Cara
Basah
Preparasi fasa diam dengan cara basah
dilakukan dengan melarutkan fasa diam dalam fase gerak yang akan digunakan.
Campuran kemudian dimasukkan ke dalam kolom dan dibuat merata. Fase gerak
dibiarkan mengalir hingga terbentuk lapisan fase diam yang tetap dan rata,
kemudian aliran dihentikan.
b)
Cara
kering
Preparasi fasa diam dengan cara kering
dilakukan dengan cara memasukkan fase diam yang digunakan ke dalam kolom
kromatografi. Fase diam tersebut selanjutnya dibasahi dengan pelarut yang akan
digunakan.
Preparasi sampel cara basah dilakukan
dengan melarutkan sampel dalam pelarut yang akan digunakan sebagai fasa gerak
dalam KCV. Larutan dimasukkan dalam kolom kromatografi yang telah terisi fasa
diam. Bagian atas dari sampel ditutupi kembali dengan fasa diam yang sama.
Sedangkan cara kering dilakukan dengan mencampurkan sampel dengan sebagian
kecil fase diam yang akan digunakan hingga terbentuk serbuk. Campuran tersebut
diletakkan dalam kolom yang telah terisi dengan fasa diam dan ditutup kembali
dengan fase diam yang sama (Sarker, 2006).
Kromatografi Vakum Cair mempunyai keuntungan yang
utama dibandingkan dengan kolom konvensional yaitu (Kasiman,
2006):
1.
Konsumsi fase gerak KCV hanya 80% atau lebih kecil disbanding dengan kolom
konvensional karena pada kolom mikrobor kecepatan alir fase gerak lebih lambat
(10-100μl/menit).
2.
Adanya aliran fase gerak lebih lambat membuat kolom mikrobor lebih ideal
jika digabung dengan spectrometer massa.
3.
Sensitivitas kolom mikrobor ditingkatkan karena solute lebih pekat
karenanya jenis kolom ini sangat bermanfaat jika jumlah sampel terbatas misal
sampel klinis.
3. Kromatografi Lapis Tipis Preparatif
Kromatografi dalam bidang kimia
merupakan sebuah tehnik analisis yang digunakan untuk memisahkan sebuah
campuran ataupun persenyawaan kimia. Tehnik ini ditemukan pada tahum 1906 oleh
Mikhail Tswett seorang ahli botani dari Italia yang lahir di Rusia. Tehnik
pemisahan ini dilakukan terhadap pigmen tumbuhan (klorofil), dengan cara
menuangkan ekstrak petroleum eter dari daun tumbuhan diatas sebuah kolom kaca
yang berisi serbuk kalsium karbonat dalam arah yang tegak lurus (Najib, 2013).
Dalam perkembangan selanjutnya metode
ini tidak hanya digunakan untuk mengidentifikasi noda, akan tetapi juga untuk
mengisolasi ekstrak. Metode ini kemudian dikenal sebagai KLT preparatif. Metode
ini paling sederhana dan murah untuk mengisolasi komponen kimia dari suatu
bahan alam, dengan menggunakan lempeng yang besar terbuat dari kaca dengan
ukuran 20 x 20 cm (Najib, 2013).
Metode kerjanya meliputi penotolen
ekstrak bahan alam dalam bentuk pita pada lempeng. Hal ini memungkinkang sampel
dalam jumlah besar dapat muat pada lempeng KLT, lempeng dikembangkan dalam
pelarut yang telah diketahui mampu memisahkan komponen, yang paling penting
adalah harus digunakan metode deteksi yang tidak merusak sampel (Najib, 2013).
Pada KLT
preparatif, cuplikan yang akan dipisahkan ditotolkan berupa garis pada salah
satu sisi plat lapisan besar dan dikembangkan secara tegak lurus pada garis
cuplikan sehingga campuran akan terpisah menjadi beberapa pita. Pita
ditampakkan dengan cara yang tidak merusak jika senyawa itu tahan warna, dan
penjerap yang mengandung pita dikerok dari plat kaca. Kemudian cuplikan dielusi
dari penjerap dengan pelarut polar. Cara ini berguna untuk memisahkan campuran
reaksi sehingga diperoleh senyawa murni untuk telaah pendahuluan, untuk
menyiapkan cuplikan analisis, untuk meneliti bahan alam yang lazimnya berjumlah
kecil dan campurannya rumit, dan untuk memperoleh cuplikan yang murni untuk
mengkalibrasi KLT kuantitatif (Gritter, 1991).
Keuntungan
KLTP adalah salah satu metode pemisahan yang memerlukan pembiayaan paling
murah dan memakai peralatan paling
dasar. Kerugian KLTP adalah
pengambilan senyawa dari plat yang dilanjutkan dengan pengekstraksian penjerap
memerlukan waktu lama dan jika senyawa beracun harus dikerok dari plat akan
menimbulkan banyak masalah serius. Serta adanya zat pencemar dan sisa dari plat sendiri setelah
pengsekstraksian pita yang mengandung senyawa yang dipisahkan dengan pelarut (Hostettmann, 1995).
Metode
kromatografi, karena pemanfaatannya yang leluasa, dipakai secara luas untuk
pemisahan analitik dan preparative. Hampir setiap campuran kimia, mulai dari
bobot molekul rendah sampai tinggi, dapat dipisahkan menjadi
komponen-komponennya dengan beberapa metode kromatografi. Jenis pemisahan,
apakah analitik atau preparatif, tidak ditentukan oleh ukuran cuplikan,
melainkan lebih oleh keperluan khusus. Biasanya, kromatografi analitik dipakai
pada tahap permulaan untuk semua cuplikan, dan kromatografi hanya dilakukan
jika diperlukan fraksi murni dari campuran (Gritter, 1991).
Kadang-kadang
kita berhasil memisahkan campuran tertentu dengan beberapa kali pengembangan
memakai sistem pelarut yang sama yang nisbi nonpolar, padahal campuran itu
tidak dapat dipisahkan dengan sekali pengembangan yang memakai sistem pelarut
yang lebih polar. Jumlah cuplikan lebih banyak dapat dipisahkan dengan cara
pengembangan berganda sehingga hal ini sangat penting pada KLT preparatif
(Gritter, 1991).
Kromatografi
pada lapisan berbentuk khusus. Kadang-kadang lapisan KLT perlu diraut menjadi
berbagai bentuk. Pada lapisan belandas kaca, bentuk itu dapat dibuat dengan
spatula atau alat yang diruncing. Lapisan berlandas plastik dapat
dipotong-potong memakai gunting (Gritter, 1991).
Ketika
pelarut muncul dari bagian lapisan yang sempit (tempat menotolkan cuplikan),
pelarut dipaksa bergerak menyamping dan sekaligus menegak. Ini berarti cuplikan
akan berbentuk pita, bukan bercak bundar. Pita ini lebih tajam dan lebih mudah
dilihat, dan kita dapat menunjukkan komponen yang lebih banyak (Gritter, 1991).
·
Kristalisasi
Kristalisasi
digunakan untuk mendapatkan bahan dalam bentuk Kristal murni.Oleh karena itu
pembentukan Kristal menyebabkan zat terlarut memisah dari lelehan atau larutan
dimana yang tidak murni tetap tertinggal dalam larutan,maka kristalisasi juga
merupakan proses pemisahan (Harborne,1987).
Bila terdapat senyawa tunggal,
beberapa senyawa dapat mengkristal. Kristal dapat dimurnikan dengan
pengkristalan kembali (rekristalisasi). Teknik ini dilakukan pada produk yang
kotor, mula-mula dilarutkan dalam sejumlah pelarut ppanas (umumnya digunakan
solven dimana produk tersebut kurang larut dibandingkan kotorannya). Jika
larutan panas tersebut dibiarkan mendingin produk yang murni memisah dari
campuran, sehingga tersisa kotoran dalam larutannya. Kristal-kristal yang
terbentuk dari produkm disaring dan dikeringkan (Najib, 2013).
Jika sebuah fraksi dipekatkan dan
didinginkan serta pelarutnya dibiarkan menguap lambat,Kristal dapat membentuk
senyawa yang murni Kristalisasi dapat dilakukan dengan sedikit penggosokan pada
bagian dalam dinding kaca selanjutnya membiarkannya di tempat dingin,bahkan
dalam lemari pendingin.Beberapa deposit mungkin merupakan kristalin dan harus
di cek dengan bantuan lensa tangan untuk meyakinkan bahwa deposit tersebut
bukan bahan yang amorf yang berasal dari larutan saat pendinginan terjadi
(Harborne,1987).
Manfaat dari
kromatografi ini yaitu menentukan ciri senyawa aktif penyebab efek racun atau
efek yang bermanfaat, yang ditunjukkan oleh ekstrak tumbuhan kasar bila diuji
dengan sistem biologi. Dalam hal ini kita harus memantau cara ekstraksi dan
pemisahan pada setiap tahap, yaitu untuk melacak senyawa aktif tersebut sewaktu
dimurnihkan. Kadang-kadang keaktifan hilang selama proses fraksinasi akibat
ketidakmantapan senyawa itu, dan akhirnya mungkin saja diperoleh senyawa berupa
kristal tetapi keaktifan seperti yang ditunjukkan oleh ekstrak asal (Harborne, 1987).
·
Uji Kemurnian
a.
KLT 2 Dimensi
Merupakan salah satu metode untuk
mengetahui kemurnian suatu senyawa dari
hasil isolat, yang di mana bertujuan untuk meningkatkan resolusi sampel ketika
komponen-komponen solute mempunyai karakterisktik kimia yang hampir sama.
Karenanya nilai Rf juga hampir sama sebagaimana dalam asam-asam amino, selain
itu 2 sistem fase gerak yang sangat berbeda dapat digunakan secara berurutan,
sehingga memungkinkan untuk melakukan pemisahan analilt yang mempunyai tingkat
polaritas yang berbeda (Sastrohamidjojo,
1985).
KLT dua arah adalah cara yang memungkinkan pemakaian lapisan fase diam
yang lebih luas untuk memisahkan campuran yang mengandung banyak komponen.
Selain itu, dua sistem pelarut yang sangat berbeda dapat digunakan secara
berurutan pada campuran tertentu, jadi memungkinkan pemisahan campuran yang
mengandung komponen yang kepolarannya sangat berbeda. Ekstrak ditotolkan dan
dielusi seperti pada KLT normal kemudian diputar 900 untuk
pengembangan kedua (Gibbons, 2006).
Penyerap umum yang
digunakan adalah silica gel, aluminium oksida, keiselgur, selullosa dan
turunannya. Poliamida dll. Silica gel
adalh penyerap umum yang banyak digunakan karena mempunyai daya pemisahan yang
baik, hal ini telah diseleksi oleh Stahl untuk pertama kali 1958 (Stahl, 1985).
Salah satu aplikasi
untuk mengetahui kemurnian senyawa hasil isolat dengan metode ini yaitu dengan
mengelusi noda pada 2 arah yang berbeda
dan menggunakan eluen yang berbeda, isolate dikatakan murni apabila noda yang
dinampakkan adalah tunggal (Stahl, 1985).
b.
Multi Eluen
Multi eluen merupakan penggunaan eluen
atau fase gerak yang berbeda yang memungkinkan pemisahan analit dengan
berdasarkan tingkat polaritas yang berbeda (Sastrohamidjojo, 1985).
Prinsipnya,
”like dissolve like” yang dapat digunakan untuk pemilihan pelarut dalam
menentukan jenis senyawa kimia yang mungkin terekstraksi dari organisme. Dimana
pelarut non polar akan mengestraksi senyawa-senyawa non polar akan terekstraksi
oleh pelarut polar, serta dapat juga digunakan untuk menganalisis kemurnian suatu isolat/senyawa
kimia yang diperoleh dari hasil isolasi dari bahan alam (Sastrohamidjojo, 1985).
KLT
Multi eluen adalah penggunaan eluen atau fase gerak yang berbeda yang
memungkinkan pemisahan analit dengan berdasarkan tingkat polaritas yang
berbeda. Dalam multi eluen, setelah pengembang tunggal menaik,kromatogram
diangkat dari chamber dan dikeringkan, biasanya selama 5-10 menit. Kromatogram
tersebut kemudian dielusi lagi dalam eluen segar dari pelarut yang sama dalam
arah yang sama untuk jarak yang sama.Proses ini, yang dapat diulang
berkali-kali, meningkatkan resolusi komponen dengan nilai RF bawah 0,5.
Beberapa pengembang dilakukan dengan pelarut yang berbeda dalam arah yang sama,
masing-masing yang menjalankan jarak yang sama atau berbeda, disebut elusi
bertahap.Sebuah fase kurang polar dapat digunakan pertama, diikuti oleh fase
yang lebih polar, atau sebaliknya. Pemindahan material nonpolar kebagian atas
lapisan,meninggalkan zat terlarut polar terganggu darimana dia berasal.
Setelahkering, zat terlarut polar dipisahkan olehpengembang dengan eluen(Cazes, 2004).
Multieluen
adalah untuk mendapatkan resolusi yang baik dari hasil KLT.Memfokuskan zona
pemisahan multi eluen, cocok digunakan untuk sampel yang memiliki noda
dengannilai Rf di bawah 0.5. Sampel
disentrifuge terlebih dahulu dengan menggunakan methanol p.a, sebabuntuk
menjamin kemurnian senyawa. Sebab, methanol p.a merupakanpelarut yang khusus
digunakan untuk analisis dan bebas dari pengotor.Berbeda dengan methanol teknis
yang bisa saja mengandung pengotor seperti plasticizer dari wadah yang
digunakan untuk menampung pelarut. agar seluruh area lempeng dapat digunakan
sehingga senyawa yang masih menumpuk dalam satu noda, dapat ter-elusi kembali
melalui sisi lempeng yang lain(Mary, 1996).
BAB
III
PROSEDUR
KERJA
III.1 Alat dan Bahan
III.1.1
Alat yang dipakai
Adapun
alat yang digunakan yaitu batang
pengaduk, chamber, gunting,
gelas ukur, kolom kaca, lampu UV 254 nm dan 366 nm, lempeng KLT, mistar,
pensil 2B, pinset, pipa kapiler, sendok tanduk
besi, statif, timbangan
analitik, dan vial.
III.1.2
Bahan yang digunakan
Adapun
bahan yang digunakan yaitu aluminium foil, DPPH, ekstrak n-heksan daun bunga terompet
(Mandivella sanderi), eluen, n-heksan : EtoAC dengan
perbandingan 7:3 , 6:4 , 5:5 , 4:6 , 3:7 , 2:8 , 1:9 dan 0:10 , label, silica gel, tissue
III.2 Cara Kerja
Cara
kerja kromatografi kolom konvensional :
1) Pengemasan
Alat isolasi
Kolom dipasang tegak lurus pada statif,kemudian
dibebas lemakkan menggunakan metanol. Bagian bawah kolom dilapisi kapas
kemudian silika gel dimasukkan sampai terisi ½ dari kolom.lalu diketuk – ketuk
sampai tidak terbentuk gelembung gas.
2) Pemisahan/isolasi
:
Silika gel ditimbang berdasarkan perbandingan 1 gram
ekstrak : 100 gram silika gel (tergantung ketersediaan ektrak dan kapasitas
kolom) . Dalam praktikum ini digunakan metode basah dimana silika gel disuspensikan
menggunakan eluen n-hexan : EtoAC dengan perbandingan 10 : 0. Kemudian suspensi
dari silika gel dimasukkan ke dalam kolom lalu dimampatkan.
Ekstraksi ditimbang berdasarkan perbandingan 1 g
ektrak : 100 g silika gel dan dikemas menggunakan metode basah yaitu sampel
disuspensikan dengan eluen dengan perbandingan 9 : 1 selapis diatas permukaan
kertas saring, selanjutnya dielusi sampai menghasilkan fraksi – fraksi dan
ditampung ke dalam vial. Eluen yang sebelumnya yang telah habis diganti dengan eluen 8 : 2 ,
kemudian secara berturut – turut
dilanjutkan dengan eluen perbandingan 7:3, 6:4, 5:5, 4:6, 3:7, 2:8, 1:9,
dan 0:10. Hasil kromatografi kolom berupa fraksi. Fraksi – fraksi digabung dan
dianggap satu fraksi berdasarkan warna atau profil KLT.
3) Pengujian
fraksi aktif antioksidan dengan metode KLT (Gibbons, 2006)
Senyawa
antioksidan adalah komponen penting dalam makanan dan berkontribusi dalam
kesehatan manusia. Sifat antioksidan dari suatu senyawa bahan alam dapat
diketahui dengan menggunakan metode uji KLT (TLC Assay). Senyawa yang mempunyai kemampuan antioksidan akan
mampuh menstabilkan radikal 2,2-diphenyl-picrylhydrazyl (DPPH). Indikasi ini
terdeteksi beberapa menit setelah penyemprotan DPPH menyebabkan terbentuknya
warna kuning dengan latarbelakang ungu.
b. Kromatograsi Cair Vakum
c. Kromatografi Lapis Tipis
Preparatif
Fraksi aktif (dari KKK dan KCV)
dilarutkan dengan n-heksan. Dibuat perbandingan eluen (9:1 atau 8:2).
Didisiapkan lempeng KLTP, lempeng yang digunakan biasanya berukuran 20 x 20 cm.
Setelah itu fraksi ditotolkan pada lempeng berbentuk pita pada garis penotolan
yang telah dibuat sebelumnya. Setelah raksi ditotolkan pada lempeng, kemudian
dikembangkan dengan eluen yang sesuai dan dapat memisahkan komonen kimia
Setelah pengembangan/elusi,
pita-pita tersebut dideteksi dan diberi tanda kemudian dikeruk yang selanjutnya
disebut sebagai isolat. Kemudian isolate tersebut dimasukkan ke dalam tabung
sentrifuge lalu disentrifuge. Selanjutnya dilakukan pengujian antioksidan pada
lempeng KLT dengan metode DPPH.
1. Pengerjaan Kromatografi
1.Penyiapan lempeng silika gel
Dibuat
lempeng dari silika gel dengan ukuran 7 cm x 1
cm menggunakan mistar
dan lempeng silika gel dipotong dengan cutter yang sebelumnya
telah diukur dan dilakukan penjenuhan chamber
kemudian disiapkan chamber yang bersih
lengkap dengan penutupnya , chamber diisi eluen n-heksan : etil
dengan perbandingan 8 : 2 dengan kepolaran yang berbeda
kemudian dimasukkan potongan kertas saring yang panjangnya
lebih dari tinggi chamber dan kemudian ditutup
dan dibiarkan hingga eluen naik pada kertas saring hingga
melewati penutup kaca (chamber telah jenuh)
2.
Penotolan
sampel pada lempeng
Disiapkan
alat dan bahan yang dibutuhkan dan fraksi-fraksi
hasil kromatografi kolom cair vakum dularutkan dengan n-heksan kemudian
masing-masing fraksi diambil dengan menggunakan pipa kapiler,
kemudian ditotolkan pada lempeng yang telah disiapkan
dan lempeng yang telah ditotol diangin-anginkan sebentar untuk
menguapkan pelarutnya lalu dimasukkan ke dalam chamber yang telah dijenuhkan
seelah itu Dilakukan pengelusian terhadap lempeng yang telah ditotol dengan
fraksi-fraksi n-heksan menggunakan eluen n-heksan:etil (8:2) dan bila eluen telah mencapai batas atas dari lempeng silica
gel, maka lempeng tersebut dapat dikeluarkan
menggunakan pinset dan diamati secara
langsung dan dengan menggunakan penampak bercak UV 254, UV 366, dan menyemprot
lempeng dengan menggunakan DPPH.
BAB
IV
Hasil
Pengamatan
IV.
1 Gambar Hasil Pengamatan
A.
Kromatografi
Kolom Konvensional
a.
Fraksi 1
b.
Fraksi 2 c. Fraksi 3
c.
Fraksi 4
d.
Fraksi 5
e.
Fraksi 6 f.
Fraksi 7
g. Fraksi 8
h. Fraksi 9
Keterangan gambar :
Fraksi 1 : Vial 1 - 17
Fraksi 2 : Vial 18
Fraksi 3 : Vial 19 - 21
Fraksi 4 : Vial 22-29
Fraksi 5 : Vial 30 - 35
Fraksi 6 : Vial 36
Fraksi 7 : Vial 37 40
Fraksi 8 : Vial 41 - 50
Fraksi 9 : Vial 51- 60
Gambar
Fraksi di Sinar UV
a.
Sinar Tampak
b.
Sinar UV 254
c.
Sinar UV 366
Perhitungan Nilai Rf
Rf
=
a. Sinar
Tampak
Tidak ada noda yang tampak
b. Sinar
UV 254
Tidak ada noda yang tampak
c. Sinar
UV 366
Tidak ada noda yang tampak
B.
Kromatografi
Cair Vakum (KCV)
- Gambar Fraksi
a.
Fraksi
1 b. Fraksi 2 c. Fraksi 3
IV.
2 Perhitungan
d.
Fraksi
4 e. Fraksi 5 e.Fraksi 6
f.
Fraksi
7 g. Fraksi 8
H.
Fraksi
9
Keterangan
gambar :
Fraksi 1 :
Eluen n-Heksan : etil asetat (15 : 1)
Fraksi 2 :Eluen
n-Heksan : etil asetat (10 : 1)
Fraksi 3 :Eluen
n-Heksan : etil asetat (5 : 1)
Fraksi 4 :Eluen
n-Heksan : etil asetat (1 : 1)
Fraksi 5 :
Eluen n-Heksan : etil asetat (0 : 5)
Fraksi 6 :Eluen
n-Heksan : etil asetat (0 : 50)
Fraksi 7 :
Pelarut Metanol 1
Fraksi 8 :
Etil asetat : Metanol (1 : 1)
Fraksi 9 :
Pelarut Metanol 2
Gambar
di sinar UV
a.
Sinar
tampak
b.
Sinar
UV 254
c. Sinar UV 366
Perhitungan
Nilai Rf
Rf
=
a.
Sinar Tampak
- Fraksi
4
Noda 1 : 4,1. Nilai Rf
=
=
0,745
Noda 2 : 4,6. Nilai Rf
=
=
0,836
Noda 3 : 5,1. Nilai Rf
=
=
0,927
- Fraksi
5
Noda 1 : 4,8. Nilai Rf
=
=
0,872
Noda 2 : 5,1. Nilai Rf
=
=
0,927
b.
Sinar UV 254
- Fraksi
4
Noda 1 : 4,1. Nilai Rf
=
=
0,745
Noda 2 : 4,6. Nilai Rf
=
=
0,836
Noda 3 : 5,1. Nilai Rf
=
=
0,927
- Fraksi
5
Noda 1 : 4,8. Nilai Rf
=
=
0,872
Noda 2 : 5,1. Nilai Rf
=
=
0,927
c.
Sinar UV 366
- Fraksi
4
Noda 1 : 4,1. Nilai Rf
=
=
0,745
Noda 2 : 4,6. Nilai Rf
=
=
0,836
Noda 3 : 5,1. Nilai Rf
=
=
0,927
- Fraksi
5
Noda 1 : 4,8. Nilai Rf
=
=
0,872
Noda 2 : 5,1. Nilai Rf
=
=
0,927
BAB V
PEMBAHASAN
Kromatografi merupakan suatu
pemisahan zat berkhasiat dan zat lain yang ada dalam bahan atau sediaan dengan
jalan penyarian berfraksi, penyerapan, atau penukaran ion pada zat berpori,
menggunakan cairan atau gas mengalir.
Pemisahan dan pemurnian kandungan tumbuhan
terutama dilakukan dengan menggunakan salah satu dari empat teknik kromatografi
atau gabungan teknik tersebut. Keempat teknik kromatografi itu adalah :
Kromatografi Kertas (KKt), Kromatografi Lapis Tipis (KLT), Kromatografi Gas
Cair (KGC) dan Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT).
Kromatografi merupakan suatu cara pemisahan
fisik dengan unsur-unsur yang akan dipisahkan terdistribusikan antara dua fasa,
satu dari fasa ini membentuk lapisan stasioner dengan luas permukaan yang besar
dan fasa lainnya merembes melewati dan melalui lapisan stasioner tersebut.
Pemisahan secara kromatografi memanfaatkan sifat fisika umum dari molekul.
Sifat utama yang terlibat adalah kecenderungan molekul untuk larut dalam cairan
(kelarutan), kecenderungan molekul untuk melekat dalam cairan (adsorpsi), dan
kecenderungan molekul untuk menguap (keatsirian)
Sampel
yang digunakan dalam praktikum ini adalah daun bunga
terompet (Mandivella sanderi ).
Dalam fitokimia dilakukan suatu proses ekstraksi, isolasi dan identifikasi dari
suatu komponen kimia dari tumbuhan dan biota laut yang banyak digunakan dalam
pengobatan tradisional yang berkembang menjadi obat modern. Menggunakan cara
yang bervariasi tergantung dari sifat fisika dan kimia komponen tersebut.
Kemudian dilanjutkan dengan proses pemurnian dengan kristalisasi dengan tujuan
mendapatkan senyawa kimia yang penampakannya bagus dan kelihatan lebih banyak.
Metode fitokimia sangat penting artinya dalam bidang farmasi sebagai salah satu
cara meneliti senyawa aktif yang terdapat dalam tumbuhan.
Dalam kromatografi,eluent adalah fasa gerak yang berperan penting pada proses
elusi bagi larutan umpan (feed) untuk melewati fasa diam (adsorbent). Interaksi antara adsorbent eluent sangat
menentukan terjadinya pemisahan
komponen. Oleh sebab itu pemisahan komponen secara kromatografi dipengaruhi oleh laju alir eluent dan jumlah umpan.
Sebagian besar dasar
teori kromatografi kolom juga dapat diterapkan pada KLT. Konsep ”lempeng teori”
lebih sukar digambarkan, tetapi pemisahan ini dilakukan oleh keseimbangan
berturutan cuplikan dalam dua fasa, satu diantaranya bergerak terhadap yang
lainnya. Terjadi proses penyebaran molekul cuplikan karena proses nonideal.
Sifat kromofor dari
struktur senyawa ini mudah dikenali di bawah lampu UV sehingga memudahkan
identifikasi dalam kromatografi lapis tipis. Pada metode isolasi senyawa β-karoten dengan cara refluks yaitu tejadi penarikan komponen kimia yang dilakukan dengan cara sampel dimasukkan ke
dalam labu alas bulat bersama-sama dengan zat pelarut (kloroform) lalu dipanaskan dan
diberikan batu didih agar pemanasan berlangsung secara merata. Uap-uap pelarut terkondensasi pada kondensor menjadi molekul-molekul
pelarut yang akan turun kembali menuju labu alas bulat, dan akan akan menyari
kembali sampel yang berada pada labu alas bulat. Demikian seterusnya
berlangsung secara berkesinambungan sampai penyarian sempurna, setelah itu filtrat yang diperoleh dipekatkan dengan cara evaporasi. Evaporasi yaitu proses pemisahan ekstrak dari cairan penyarinya dengan pemanasan yang
dipercepat oleh putaran dari labu alas bulat. Dengan bantuan pompa vakum, uap
larutan penyari akan menguap naik ke kondensor dan mengalami kondensasi menjadi
molekul-molekul cairan pelarut murni yang ditampung dalam labu alas bulat.
a.
Kromatografi
Kolom Konvensional
(KKK)
Pada metode ini, kolom diisikan dengan adsorben
yang berupa padatan dalam hal ini adalah silika gel yang
dicampurkan dengan pelarut n – heksan hingga membentuk bubur silika (slurry). Slurry
dimasukkan dengan hati-hati kedalam kolom kromatografi yang telah diisikan n-heksan yang sebelumnya telah
disumbat dengan kapas dan kertas saring yang berfungsi sebagai penahan adsorben
agar tidak keluar bersama eluen. Pengisian kolom harus dikerjakan secara
seragam dan sepadat mungkin untuk menghindari terjadinya gelembung-gelembung
udara. Jika terdapat gelembung-gelembung udara dalam kolom maka akan berpotensi
menyebabkan pecahnya kolom.
Prinsip dari kromatografi kolom jenis
ini adalah kecenderungan komponen kimia untuk terdistribusi ke dalam fase diam
atau fase gerak dengan proses elusi berdasarkan gaya gravitasi. Kolom
kromatografi atau tabung untuk pengaloran karena gaya tarik bumi (gravitasi)
atau system bertekanan rendah biasanya terbuat dari kaca yang dilengkapi dengan
kran.
Hal lain yang dapat dilakukan agar tidak terjadi pemecahan
kolom adalah dengan menambahkan eluen secara kontinu agar udara tidak masuk
kedalam kolom. Kolom yang padat diindikasikan dengan warna slurry yang semakin
memutih dan kecepatan alir eluen yang semakin lambat. Jika kolom sudah memadat, larutan sampel kemudian diisikan kedalam kolom . Mekanisme yang
terjadi pada kromatografi kolom ialah sample akan terelusi oleh eluen (n-heksan) melalui fase diam silika gel.
Senyawa organik terelusi oleh eluen proses elusi terjadi karena keseimbangan
distribusi zat analit pada fase gerak n-heksan dan fase diam selika gel. Elusi
terus berlangsung hingga tidak ada lagi yang tinggal dalam kolom. Proses elusi
ini menghasilkan eluat yang diharapkan mengandung banyak betakaroten.
Kelebihan
kromatografi kolom :
1.
Dapat digunakan untuk analisis dan aplikasi preparative
2. Digunakan untuk menentukan jumlah komponen campuran
3. Digunakan untuk memisahkan dan purifikasi substansi
Kekurangan kromatografi kolom :
1. Untuk mempersiapkan kolom dibutuhkan kemampuan teknik dan manual
2. Metode ini sangat membutuhkan waktu yang lama (time consuming)
2. Digunakan untuk menentukan jumlah komponen campuran
3. Digunakan untuk memisahkan dan purifikasi substansi
Kekurangan kromatografi kolom :
1. Untuk mempersiapkan kolom dibutuhkan kemampuan teknik dan manual
2. Metode ini sangat membutuhkan waktu yang lama (time consuming)
Berdasarkan hasil percobaan dapat
disimpulkan bahwa daun bunga terompet (Mandevillae
folium) didapatlan hasil kromatografi kolom dengan jumlah fraksi 9 dan
menggunakan 7 eluen berdasarkan tingkat kepolaran yang lebih tinggi yang
selanjutnya akan diisolasi kembali dengan metode yang cocok. Pada sinar UV
tidak menampakkan noda, hal tersebut dapat disebabkan adanya faktor kesalahan
b. Kromatografi Cair
Vakum
Kromatografi Cair Vakum (KCV) merupakan salah satu metode
fraksinasi yaitu dengan memisahkan crude extract menjadi fraksi-fraksinya yang lebih sederhana.
Pemisahan tersebut memanfaatkan kolom yang berisi fasa diam dan aliran fasa geraknya
dibantu dengan pompa vakum. Fasa diam yang digunakan dapat berupa silika gel
atau alumunium oksida
Setelah ekstrak dievaporasi kemudian dilanjutkan
proses pemisahan dengan menggunakan metode kromatografi kolom. Adapun cara kerja kromatografi cair vakum yaitu kolom kromatografi dikemas
kering dengan penjerap silika gel KL 254 dalam keadaan vakum agar diperoleh
kerapatan kemasan maksimum. Vakum dihentikan, pelarut yang kepolarannya rendah
(n-heksana) dituangkan ke permukaan penjerap lalu divakumkan lagi. Kolom
dipisah sampai kering dan sekarang siap dipakai. Sampel dilarutkan dalam
pelarut yang cocok, dimasukkan langsung pada bagian atas kolom dan dihisap
perlahan-lahan ke dalam kemasan dengan mengvakumkannya. Kolom, dielusi dengan
campuran pelarut yang cocok, mulai dengan pelarut yang kepolarannya rendah
(n-heksana) lalu kepolaran ditingkatkan perlahan-lahan dengan cara elusi
gradien antara n-heksana:etil asetat:metanol, kolom dihisap sampai kering pada
setiap pengumpulan fraksi.
Pengaruh lebarnya kolom pada KVC
mengakibatkan fraksi sampel turun satu persatu, dan bila pelarutnya telah habis
maka harus dibuat pelarut dengan kosentrasi sama, dan diturunkan kembali
fraksinya. Sedangkan panjang kolom, mengakibatkan semakin panjang kolom maka
waktu atau cepat lambatnya turun fraksi senyawa.
Adapun keuntungan dan kerugian dari kromatografi
kolom adalahsebagai berikut :
a.Keuntungan
1.Konsumsi fase gerak KCV hanya 80% atau lebih kecil
disbandingdengan kolom konvensional karena pada kolom mikrobor kecepatan alir
fase gerak lebih lambat (10-100μl/menit)
2.Adanya aliran fase gerak lebih lambat membuat kolom
mikrobor lebih ideal jika digabung dengan spectrometer massa.
3.Sensitivitas kolom mikrobor ditingkatkan karena solute lebih
pekatkarenanya jenis kolom ini sangat bermanfaat jika jumlah sampelterbatas
missal sampel klinis
b.Kerugian KCV (Kromatografi Vakum Cair) :
1.Membutuhkan waktu yang
cukup lama
2.Sampel yang dapat digunakan terbatas
Berdasarkan hasil percobaan dapat
disimpulkan bahwa daun bunga terompet (Mandevillae
folium) didapatkan hasil kromatografi kolom dengan jumlah fraksi 9 dan
menggunakan 7 eluen. Berdasarkan hasil noda yang tampak ada 2 fraksi yang
menampakkan noda pada fraksi 4, noda 1 : 4,1 cm memiliki nilai Rf = 0,745, noda
2 : 4,6 cm memiliki nilai Rf = 0,836, noda 3 : 5,1 cm memiliki nilai Rf =
0,927. Sedangkan pada fraksi 5, noda 1 : 4,8 cm memiliki nilai Rf = 0,872, dan
pada noda 2 : 5,1 cm memiliki nilai Rf = 0,927. Senyawa tersebut selanjutnya
akan diisolasi kembali dengan menggunakan metode pemisahan yang cocok,
seperti Kromatografi Preparatif.
C.
Kromatografi
Lapis Tipis Preparatif (KLTP)
Kromatografi
lapis tipis preparatif (KLTP) adalah salah satu metode yang memerlukan
pembiayaan paling murah dan memakai peralatan paling dasar. Walaupun KLTP dapat
memisahkan bahan dalam jumlah gram, sebagian besar pemakainya hanya dalam
jumlah miligram.KLTP bersama-sama dengan kromatografi kolom terbuka, masih
dijumpai dalam sebagian besar publikasi mengenai isolasi bahan alam.
Cuplikan
pada KLTP dilarutkan dalam sedikit pelarut sebelum ditotolkan pada pelat KLTP.
Pelarut yang baik adalah pelarut atsiri ( heksana, diklorometana, etil asetat),
karena jika pelarut kurang atsiri akan terjadi pelebaran pita. Konsentrasi
cuplikan harus sekitar 5% - 10%. Cuplikan ditotolkan berupa pita yang harus
sesempit mungkin karena pemisahan tergantung pada lebar pita.
KLTP
klasik mempunyai beberapa kekurangan, kekurangan yang utama adalah pengambilan
senyawa dari pelat yang dilanjutkan dengan pengekstrasian dari penjerap. Jika
senyawa beracun harus dikerok dari pelat, dapat menimbulkan masalah yang serius
(misalnya Adolf dkk. 1982). Kekurangan yang lainya ialah jangka waktu yang
diperlukn untuk pemisahan dan adanya pencemar dan sisa dari pelat sendiri
setelah pengekstrasian pita yang mengandung senyawa yang dipisahkan dengan
pelarut (Szekely 1983).
Untuk
mengatasi beberapa masalah tersebut, beberapa pendekatan yang melibatkan
kromatografi sentrifugal telah dicoba. Pada prinsipnya kromatografi sentrifugal
adalah kromatografi klasik dengan aliran fase gerak yang dipercepat oleh gaya
sentrifugal.
Adapun
keuntungan dan kerugiaan KLTP yaitu :
keuntungan
:
Salah satu pemisahan yang memerlukan pembiayaan paling murah
danmemakai peralatan paling dasar adalah kromatografi lapis tipis preparatif.
Kerugian:
Ketebalan dari lempeng menyebabkan waktu yang dibutuhkan
menjadilebih lama dibadingkan dengan KLT pada umumnya.
Setelah fraksi senyawa
didapatkan, selanjutnya dengan menggunakan KLT kita menghitung Rf
(retention fraksion), dimana bila didapat senyawa yang Rfnya sama
atau pola nodanya sama, maka kemungkinan senyawa itu adalah sama. Dan terakhir,
kita uji fitokimia dari senyawa tersebut (ekstraks n- heksana kulit batang
nangka). Namun langkah ini tidak dapat dilakukan karena waktu yang tidak
mengizinkan lagi.
Adapun mekanisme
dan prinsip penampakan noda pada pegujian Kromatigrafi yaitu :
a. Pada UV 254
nm
Pada UV 254 nm, lempeng akan berflouresensi sedangkan sampel akan tampak
berwarna gelap.Penampakan noda pada lampu UV 254 nm adalah karena adanya daya
interaksi antara sinar UV dengan indikator fluoresensi yang terdapat pada
lempeng. Fluoresensi cahaya yang tampak merupakan emisi cahaya yang dipancarkan
oleh komponen tersebut ketika elektron yang tereksitasi dari tingkat energi
dasar ke tingkat energi yang lebih tinggi kemudian kembali ke keadaan semula
sambil melepaskan energi.
b. Pada UV 366 nm
Pada
UV 366 nm noda akan berflouresensi dan lempeng akan berwarna gelap. Penampakan
noda pada lampu UV 366 nm adalah karena adanya daya interaksi antara sinar UV
dengan gugus kromofor yang terikat oleh auksokrom yang ada pada noda tersebut.
Fluoresensi cahaya yang tampak merupakan emisi cahaya yang dipancarkan oleh
komponen tersebut ketika elektron yang tereksitasi dari tingkat energi dasar ke
tingkat energi yang lebih tinggi kemudian kembali ke keadaan semula sambil
melepaskan energi. Sehingga noda yang tampak pada lampu UV 366 terlihat terang
karena silika gel yang digunakan tidak berfluororesensi pada sinar UV 366 nm.
c.
Penyemprotan dengan DPPH
Salah
satu metode yang digunakan untuk pengujian aktivitas antioksidan adalah metode
DPPH. Metode DPPH didasarkan pada kemampuan antioksidan untuk menghambat
radikal bebas dengan mendonorkan atom hidrogen. Perubahan warna ungu DPPH menjadi
ungu kemerahan dimanfaatkan untuk mengetahui aktivitas senyawa antioksidan. Metode ini menggunakan kontrol positif sebagai pembanding untuk mengetahui
aktivitas antioksidan sampel.
Noda-noda yang diperoleh biasanya berekor disebabkan karena :
1. Penotolan yang berulang-ulang dan letaknya
tidak tepat
2. Kandungan senyawa yang terlalu asam atau basa
3. Lempeng yang tidak rata
BAB V
PENUTUP
V.1 Kesimpulan
A.
Kromatografi Kolom Konvensional
Berdasarkan hasil percobaan dapat
disimpulkan bahwa daun bunga terompet (Mandevillae
folium) didapatlan hasil kromatografi kolom dengan jumlah fraksi 9 dan
menggunakan 7 eluen berdasarkan tingkat kepolaran yang lebih tinggi yang
selanjutnya akan diisolasi kembali dengan metode yang cocok. Pada sinar UV
tidak menampakkan noda, hal tersebut dapat disebabkan adanya faktor kesalahan.
B. Kromatografi Cair Vakum (KCV)
Berdasarkan hasil percobaan dapat
disimpulkan bahwa daun bunga terompet (Mandevillae
folium) didapatkan hasil kromatografi kolom dengan jumlah fraksi 9 dan
menggunakan 7 eluen. Berdasarkan hasil noda yang tampak terdapat 2 fraksi yang
menampakkan noda yaitu pada fraksi 4 dan fraksi 5 .Pada Fraksi 4, noda 1
memiliki nilai Rf = 0,745, noda 2 memiliki nilai Rf = 0,836, dan noda 3 memiliki nilai Rf = 0,927. Sedangkan
pada fraksi 5, noda 1 memiliki nilai Rf = 0,872, dan pada noda 2 memiliki nilai
Rf = 0,927. Senyawa tersebut selanjutnya akan diisolasi kembali dengan
menggunakan metode pemisahan yang cocok, seperti Kromatografi Preparatif.
V.2
Saran
Diharapkan kebersihan
dan bahan lebih dilengkapi dilaboratorium agar praktikum lebih lancar.
DAFTAR PUSTAKA
Hayani, E., 2007. “Pemisahan Komponen
Rimpang Temu Kunci Secara Kromatografi Kolom”.Buletin Teknik Pertanian Vol.
12 No. 1.
Khopkar, S.M. 2002. Konsep Dasar Kimia Analitik.
UI-Press. Jakarta.
Sastrohamidjojo, Hardjono.1985. Kromatografi Edisi kedua, Liberty. Yogyakarta
Soebagio, dkk. 2000. Kimia Analitik II. JICA. Malang
Sumar Hendayana. 2010. Kimia
Pemisahan. PT Remaja Rosdakarya,. Bandung.
Yazid, Estien. 2005. Kimia Fisika
untuk Paramedis. Andi. Yogyakarta
Tidak ada komentar:
Posting Komentar